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详细介绍
阳性细胞筛选是基因编辑的核心环节，其效率直接影响实验周期与成功率。
核心目标
从混合细胞群中分离成功编辑的细胞（如基因敲除/KO、敲入/KI）。
排除野生型细胞干扰（未编辑细胞占比高时，易导致假阴性）。
关键挑战
细胞损伤：长期筛选导致细胞老化（猪成纤维细胞传代后增殖能力骤降）。
假阳性风险：部分编辑未wan全破坏基因功能（如移码突变未致功能丧失）。
通量瓶颈：传统单克隆培养需22天以上，且阳性率不足20%。
利用修复机制触发荧光/抗性标记表达，实现可视化和快速分选：
| 修复机制 | 报告系统设计 | 筛选方法 | 优势 | 案例 |
|---|---|---|---|---|
| NHEJ | 靶向破坏荧光蛋白终止子→恢复表达 | FACS分选GFP⁺细胞 | 直观高效，适用于KO | CRISPR-DIY载体 |
| HDR | 同源重组插入抗性基因（如Puroᵣ） | 抗生素压力筛选 | 适合KI，成本低 | 碧云天CRISPR质粒 |
| SSA | 断裂诱导单链退火修复→荧光蛋白重构 | 流式细胞术 | 灵敏度高，脱靶率低 | 多重基因编辑验证 |
操作流程（以NHEJ-GFP系统为例）：
构建含GFP-TAA终止子的编辑载体（sgRNA靶向TAA区域）。
转染细胞后，NHEJ修复破坏终止子→GFP表达。
72h后使用流式细胞仪（如iQue®）分选GFP⁺细胞。
突破性方案：仅需50个细胞即可完成基因型鉴定，缩短周期15天以上。
关键参数：
细胞量：≥50个（20细胞组检出率不足，P<0.01）。
酶切灵敏度：T7E1可检测≥5%的编辑效率。
验证步骤：Sanger测序确认突变类型（如插入/缺失）。
| 方法 | 原理 | 适用场景 | 局限 |
|---|---|---|---|
| T7E1酶切 | 错配切割产生异源双链 | 初筛（低成本） | 灵敏度低（≥5%编辑率） |
| Sanger测序 | 直接读取序列变异 | 单克隆验证 | 通量低 |
| 高通量测序 | 深度覆盖靶位点突变 | 多基因/脱靶分析 | 成本高 |
操作优化：
混合克隆预筛：FA-PCR检测群体编辑率，＞30%时再分选单克隆。
双验证策略：T7E1初筛阳性克隆 → Sanger测序确认（避免假阳性）。
| 细胞类型 | 推荐方法 | 理由 |
|---|---|---|
| 原代细胞 | 微量细胞鉴定法 | 避免长期培养致老化（猪成纤维细胞） |
| 肿瘤细胞系 | 抗生素筛选 + FACS | 增殖快，耐药性稳定 |
| iPSCs | HDR报告系统 + 单克隆测序 | 维持多能性，需高精度编辑 |
| 编辑类型 | 筛选技术 | 关键指标 |
|---|---|---|
| 基因敲除（KO） | NHEJ-GFP报告系统 | GFP⁺细胞占比（流式定量） |
| 基因敲入（KI） | 抗生素筛选 + PCR验证 | 抗性存活率 + 侧翼序列扩增 |
| 点突变（PM） | T7E1 + 深度测序 | 突变频率＞90% |
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